熒光顯微鏡工作原理
多采用200W的(de)超(chao)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)作(zuo)光(guang)源(yuan)，它(ta)是(shi)用(yong)石(shi)英(ying)玻(bo)璃(li)製(zhi)作(zuo)，中(zhong)間(jian)呈(cheng)球(qiu)形(xing)，內(nei)充(chong)一(yi)定(ding)數(shu)量(liang)的(de)汞(gong)，工(gong)作(zuo)時(shi)由(you)兩(liang)個(ge)電(dian)極(ji)間(jian)放(fang)電(dian)，引(yin)起(qi)水(shui)銀(yin)蒸(zheng)發(fa)，球(qiu)內(nei)氣(qi)壓(ya)迅(xun)速(su)升(sheng)高(gao)，當(dang)水(shui)銀(yin)完(wan)全(quan)蒸(zheng)發(fa)時(shi)，可(ke)達(da)50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超(chao)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)的(de)發(fa)光(guang)是(shi)電(dian)極(ji)間(jian)放(fang)電(dian)使(shi)水(shui)銀(yin)分(fen)子(zi)不(bu)斷(duan)解(jie)離(li)和(he)還(hai)原(yuan)過(guo)程(cheng)中(zhong)發(fa)射(she)光(guang)量(liang)子(zi)的(de)結(jie)果(guo)。它(ta)發(fa)射(she)很(hen)強(qiang)的(de)紫(zi)外(wai)和(he)藍(lan)紫(zi)光(guang)，足(zu)以(yi)激(ji)發(fa)各(ge)類(lei)熒(ying)光(guang)物(wu)質(zhi)，因(yin)此(ci)，為(wei)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)普(pu)遍(bian)采(cai)用(yong)。
1．激發濾板根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長範圍的激發光。
紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。
熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區別
熒ying光guang顯xian微wei鏡jing是shi利li用yong紫zi外wai線xian為wei光guang源yuan，用yong以yi照zhao射she被bei檢jian驗yan的de物wu體ti，使shi該gai物wu體ti發fa出chu光guang源yuan，然ran後hou在zai顯xian微wei鏡jing下xia進jin行xing對dui物wu體ti的de觀guan察cha。主zhu要yao是shi用yong於yu免mian疫yi熒ying光guang細xi胞bao，主zhu要yao是shi由you光guang源yuan、濾lv板ban係xi統tong和he光guang學xue係xi統tong組zu成cheng的de在zai通tong過guo目mu鏡jing和he物wu鏡jing的de放fang大da來lai觀guan察cha樣yang本ben的de熒ying光guang圖tu像xiang。我wo們men來lai看kan下xia這zhe熒ying光guang顯xian微wei鏡jing和he普pu通tong光guang學xue顯xian微wei鏡jing有you什shen麼me樣yang的de區qu別bie。
1、在照明方式上看
熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放於試驗樣本上。
2、在分辨率上看
熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長比較短，但是分辨率卻高於普通的光學顯微鏡。
3、在濾光片上的不同
熒ying光guang顯xian微wei鏡jing是shi用yong了le兩liang個ge特te殊shu的de濾lv光guang片pian，在zai光guang源yuan前qian用yong是shi用yong來lai濾lv出chu可ke見jian光guang，在zai物wu鏡jing和he目mu鏡jing之zhi間jian的de使shi用yong來lai濾lv出chu紫zi外wai線xian，這zhe樣yang可ke以yi保bao護hu人ren的de眼yan睛jing。
熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)也(ye)屬(shu)於(yu)光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)一(yi)種(zhong)，主(zhu)要(yao)是(shi)銀(yin)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)所(suo)激(ji)發(fa)的(de)波(bo)長(chang)短(duan)，所(suo)以(yi)這(zhe)才(cai)導(dao)致(zhi)了(le)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)和(he)普(pu)通(tong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)雜(za)結(jie)構(gou)構(gou)造(zao)和(he)使(shi)用(yong)上(shang)的(de)不(bu)同(tong)，熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)大(da)都(dou)有(you)良(liang)好(hao)的(de)捕(bu)捉(zhuo)弱(ruo)光(guang)的(de)功(gong)能(neng)，所(suo)以(yi)在(zai)極(ji)其(qi)微(wei)弱(ruo)的(de)熒(ying)光(guang)下(xia)，它(ta)的(de)成(cheng)像(xiang)能(neng)力(li)也(ye)和(he)好(hao)。再(zai)加(jia)上(shang)近(jin)年(nian)來(lai)對(dui)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)不(bu)斷(duan)改(gai)善(shan)，噪(zao)音(yin)也(ye)大(da)幅(fu)度(du)降(jiang)低(di)。因(yin)此(ci)越(yue)來(lai)越(yue)多(duo)的(de)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)得(de)到(dao)應(ying)用(yong)。
以上是關於熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡的區別，了解這些以後，在鑒別是不是熒光顯微鏡會有很大的幫助。
熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡區別及特性
熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標本，而是利用定波長的光(通常是紫外光、藍紫光)jifaxianweijingxiabiaobenneideyingguangwuzhi，shizhifasheyingguang，suoyi，yingguangxianweijingdeguangyuansuoqidezuoyongbushizhijiezhaoming，ershizuoweizhongjifabiaobendeneiyingguangwuzhidenengyuan。womenzhisuoyinengguanchabiaoben，bushiyouyuguangyuandezhaoming，ershibiaobenneiyingguangwuzhixishoujifadeguangnenghousuochengxiandeyingguangxianxiang。youcikezhi，yingguangxianweijingdetedian，zhuyaoshitadeguangyuannenggonggeidaliangtedingbochangfanweidejifaguang，shishoujianbiaobenneideyingguangwuzhinenghuodebiyaoqiangdudejifaguang。tongshi，yingguangxianweijingbixujubeixiangyingdelvguangjingxitong。yingguangxianweijingshi**熒光組織化學的基本工具。它是由超壓光源、濾片係統(包括激發和壓製濾板)、光學係統和攝影係統等主要部件組成，是利用定波長的光激發標本發射熒光。
1.激發熒光的方式：按光的波長範圍分為UV激發法(使用紫外線照明法)和BV激發法(使用藍紫光)兩種。UV激發法是用短於400nm的(de)近(jin)紫(zi)外(wai)光(guang)進(jin)行(xing)激(ji)發(fa)。該(gai)法(fa)不(bu)存(cun)在(zai)可(ke)見(jian)的(de)激(ji)發(fa)光(guang)，所(suo)以(yi)被(bei)觀(guan)察(cha)的(de)熒(ying)光(guang)呈(cheng)現(xian)該(gai)染(ran)料(liao)固(gu)有(you)的(de)熒(ying)光(guang)，容(rong)易(yi)判(pan)別(bie)標(biao)本(ben)上(shang)的(de)特(te)異(yi)熒(ying)光(guang)和(he)背(bei)景(jing)組(zu)織(zhi)的(de)自(zi)身(shen)熒(ying)光(guang)。
2.BV激發法：是以404nm、434nmweizhongxindeyouziwaizhilanguangjinxingjifa。gaifangfashiyonglanguangzhaoshebiaoben，suoyiyingguangguanchaxitongdejiezhilvguangpianbixushiyongkewanquanzuduanlanguangbingkechongfentongguosuoxulv、黃熒光的濾光片。用於熒光抗體法的熒光色素。對於激發光的大吸收波長和熒光的大發光波長比較接近，所以BV激(ji)發(fa)法(fa)使(shi)用(yong)的(de)濾(lv)光(guang)片(pian)必(bi)須(xu)使(shi)用(yong)銳(rui)截(jie)止(zhi)式(shi)濾(lv)光(guang)片(pian)。該(gai)法(fa)可(ke)用(yong)藍(lan)光(guang)作(zuo)為(wei)激(ji)發(fa)光(guang)，所(suo)以(yi)熒(ying)光(guang)色(se)素(su)的(de)吸(xi)收(shou)效(xiao)率(lv)較(jiao)，可(ke)得(de)到(dao)較(jiao)明(ming)亮(liang)的(de)圖(tu)像(xiang)。其(qi)缺(que)點(dian)是(shi)500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發法的缺點往往影響大。
熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡光源的區別
熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈，但近年來也使用高功率LED作光源，而普通光學顯微鏡通常隻有鹵素或LEDdenglaizhaoming。yingguangxianweijingdezhaomingfangshiyibanshiyongluosheshi，yejiushishuoguangyuanshitongguowujinglaitoufangyushiyanyangbenshang，erputongguangxuexianweijingshizhijieyongguangyuanzhaosheyangpin，congerjinxingdeguancha。zaifenbianlvshangjiang，yingguangxianweijingliyongdeshiziwaixianguangyuan，bochangbijiaoduan，danshifenbianlvquegaoyuputongdeguangxuexianweijing。zailvguangpiandeshiyongshang，yingguangxianweijingshiyonglelianggeteshudelvguangpian，zaiguangyuanqiandezuoyongshiyonglailvchukejianguang，zaiwujinghemujingzhijiandezuoyongshiyonglailvchuziwaixian，yibaohuguanchazhedeyanjing。yingguangxianweijingyuputongguangxuexianweijingdequbiedazhijiushizhexie。
熒光顯微鏡使用方法
1、用窗簾遮蔽光線，關閉房間內的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，並轉動燈箱卡圈上的撥杆，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱後的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大於額定電壓值的5%，即(ji)可(ke)按(an)下(xia)啟(qi)動(dong)開(kai)關(guan)點(dian)燃(ran)汞(gong)燈(deng)，如(ru)因(yin)天(tian)氣(qi)太(tai)冷(leng)或(huo)電(dian)壓(ya)不(bu)穩(wen)定(ding)等(deng)原(yuan)因(yin)，一(yi)次(ci)啟(qi)動(dong)未(wei)點(dian)燃(ran)汞(gong)燈(deng)，可(ke)以(yi)多(duo)按(an)幾(ji)次(ci)。待(dai)超(chao)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)弧(hu)光(guang)達(da)到(dao)穩(wen)定(ding)狀(zhuang)態(tai)並(bing)達(da)到(dao)Zda發光效率，即可開始工作。
4、燈泡的使用調中：
①任選一塊標本放在熒光顯微鏡載物台上。
②轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉動濾色片組轉換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發濾色片組轉入光路，並將25熒光物鏡轉入光路。
③調節粗微調手輪，將標本像調焦清晰。
④前qian後hou推tui動dong垂chui直zhi照zhao明ming器qi右you邊bian的de聚ju光guang鏡jing調tiao焦jiao推tui杆gan，使shi視shi場chang光guang欄lan成cheng像xiang清qing晰xi，轉zhuan動dong視shi場chang光guang欄lan撥bo杆gan將jiang視shi場chang光guang欄lan收shou小xiao，調tiao節jie視shi場chang光guang欄lan調tiao中zhong螺luo釘ding使shi視shi場chang光guang欄lan居ju中zhong，然ran後hou再zai將jiang視shi場chang光guang欄lan開kai至zhiZda。
⑤轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前後調節燈箱上的聚光鏡撥杆，使汞燈的弧光在視場內成像清晰。
⑥調整燈箱上的燈泡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調整反光鏡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。
5、熒光顯微鏡使用過程中熒光觀察：
①將熒光染色標本放到熒光顯微鏡載物台上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉入光路，調節載物台縱橫移動手輪，將標本移入光路。
③轉(zhuan)動(dong)濾(lv)光(guang)片(pian)轉(zhuan)換(huan)撥(bo)輪(lun)，將(jiang)熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)標(biao)本(ben)所(suo)需(xu)要(yao)的(de)激(ji)發(fa)濾(lv)光(guang)片(pian)組(zu)轉(zhuan)入(ru)光(guang)路(lu)。激(ji)發(fa)濾(lv)光(guang)片(pian)組(zu)編(bian)號(hao)刻(ke)在(zai)濾(lv)片(pian)組(zu)轉(zhuan)換(huan)撥(bo)輪(lun)上(shang)。濾(lv)光(guang)片(pian)選(xuan)擇(ze)正(zheng)確(que)與(yu)否(fou)，是(shi)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)能(neng)否(fou)得(de)到(dao)正(zheng)確(que)應(ying)用(yong)的(de)關(guan)鍵(jian)。選(xuan)用(yong)濾(lv)光(guang)片(pian)時(shi)，必(bi)須(xu)遵(zun)守(shou)斯(si)托(tuo)克(ke)斯(si)定(ding)律(lv)：激發濾光片的透射波長<雙色束分離器的透射波長<阻斷濾光片的透射波長。
④調節粗調手輪，當看清熒光圖像輪廓後，再用微調手輪調焦，直至看到清晰的熒光圖像。
⑤當需要得到較強的熒光圖像時，可轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。
⑥當需要使用40x或100xyingguangwujingguanchashi，yingzaibiaobenhewujingjianjiashangganyou，youzhongbunengyouyingxiangguanchadexiaopaohuozazhi。shiyongshikeshiganyoumanmanjinrunyihuier，ranhouqingqingzuoyoulaihuizhuandongwujingzhuanhuanqiyipaichuqipao。
6、熒光顯微攝影
由(you)於(yu)熒(ying)光(guang)圖(tu)像(xiang)一(yi)般(ban)均(jun)較(jiao)明(ming)場(chang)觀(guan)察(cha)暗(an)得(de)多(duo)，所(suo)以(yi)進(jin)行(xing)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)攝(she)影(ying)需(xu)要(yao)較(jiao)長(chang)的(de)曝(pu)光(guang)時(shi)間(jian)，在(zai)曝(pu)光(guang)時(shi)應(ying)注(zhu)意(yi)避(bi)免(mian)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)震(zhen)動(dong)。為(wei)了(le)縮(suo)短(duan)曝(pu)光(guang)時(shi)間(jian)，可(ke)選(xuan)擇(ze)倍(bei)率(lv)較(jiao)低(di)的(de)攝(she)影(ying)目(mu)鏡(jing)或(huo)感(gan)光(guang)度(du)較(jiao)高(gao)的(de)攝(she)影(ying)膠(jiao)片(pian)如(ru)ASA200以上或DIN24以上。
熒ying光guang顯xian微wei鏡jing攝she影ying技ji術shu對dui於yu記ji錄lu熒ying光guang圖tu像xiang十shi分fen必bi要yao，由you於yu熒ying光guang很hen易yi褪tui色se減jian弱ruo，要yao即ji時shi攝she影ying記ji錄lu結jie果guo。方fang法fa與yu普pu通tong顯xian微wei攝she影ying技ji術shu基ji本ben相xiang同tong。因yin紫zi外wai光guang對dui熒ying光guang猝cu滅mie作zuo用yong大da，如ruFITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影係統裝置。
7、熒光圖像的記錄方法
熒ying光guang顯xian微wei鏡jing所suo看kan到dao的de熒ying光guang圖tu像xiang，一yi是shi具ju有you形xing態tai學xue特te征zheng，二er是shi具ju有you熒ying光guang的de顏yan色se和he亮liang度du，在zai判pan斷duan結jie果guo時shi，必bi須xu將jiang二er者zhe結jie合he起qi來lai綜zong合he判pan斷duan。結jie果guo記ji錄lu根gen據ju主zhu觀guan指zhi標biao，即ji憑ping工gong作zuo者zhe目mu力li觀guan察cha。作zuo為wei一yi般ban定ding性xing觀guan察cha，基ji本ben上shang是shi可ke靠kao的de。
8、熒光顯微鏡使用結束，關閉電源，做好鏡頭和載物台的清潔工作，待燈室冷卻至室溫後，用防塵罩蓋好顯微鏡，並做好使用記錄。
熒光顯微鏡使用步驟
1.關閉房間內的電燈，開啟顯微鏡汞燈；
2.根據樣品標記的熒光素選擇相應的濾光片；
3.放好樣品，找到合適的視野；
4.如需拍照，請確認照相機內已裝好彩色膠卷（zui好使用27定膠卷）；
5.開啟自拍裝置，選擇手動檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內；
6.使用結束，關閉電源並做好使用記錄。
熒光顯微鏡使用注意事項
1、嚴格按照熒光顯微鏡說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
2、熒光顯微鏡應在暗室中進行檢查。進入暗室後，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
3、防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。
4、檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min後，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過2～3h。
5、熒ying光guang顯xian微wei鏡jing光guang源yuan壽shou命ming有you限xian，標biao本ben應ying集ji中zhong檢jian查zha，以yi節jie省sheng時shi間jian，保bao護hu光guang源yuan。天tian熱re時shi，應ying加jia電dian扇shan散san熱re降jiang溫wen，新xin換huan燈deng泡pao應ying從cong開kai始shi就jiu記ji錄lu使shi用yong時shi間jian。燈deng熄xi滅mie後hou欲yu再zai用yong時shi，須xu待dai燈deng泡pao充chong分fen冷leng卻que後hou才cai能neng點dian燃ran。中zhong應ying避bi免mian數shu次ci點dian燃ran光guang源yuan。
6、標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。
7、熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”表示無或可見微弱熒光。“+”表示僅能見明確可見的熒光。“++”表示可見有明亮的熒光。“+++”表示可見耀眼的熒光。
8、其它注意事項、熒ying光guang顯xian微wei鏡jing所suo看kan到dao的de熒ying光guang圖tu像xiang，一yi是shi具ju有you形xing態tai學xue特te征zheng，二er是shi具ju有you熒ying光guang的de顏yan色se和he亮liang度du，在zai判pan斷duan結jie果guo時shi，必bi須xu將jiang二er者zhe結jie合he起qi來lai綜zong合he判pan斷duan。熒ying光guang顯xian微wei鏡jing攝she影ying技ji術shu對dui於yu記ji錄lu熒ying光guang圖tu像xiang十shi分fen必bi要yao，由you於yu熒ying光guang很hen易yi褪tui色se減jian弱ruo，要yao即ji時shi攝she影ying記ji錄lu結jie果guo。
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